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结核病疫苗的研究进展
作者: 发表日期:2013-11-27

  结核病是严重影响人类健康的慢性传染病。由于移民、吸毒、人类免疫缺陷病毒(HIV) 与结核杆菌伴发感染和结核杆菌耐多药性等因素,全球每1 秒钟就有1 个新感染者出现,每年新发结核病人达850 万,300 万人死于结核病。目前,全球已有20 亿人感染结核菌。结核病不仅已成为21 世纪严重危害人类健康的公共卫生问题,而且也已成为严重的社会问题。这给全球结核病防治工作提出了新的挑战。结核病的严峻形势促使全球基金机构和科学家探讨新的方法来治疗和预防结核病。显然,发明一种能有效预防结核杆菌感染的疫苗是控制结核病的关键。 卡介苗(BCG) 是惟一获准用于预防结核病的疫苗。BCG能有效预防儿童结核病,但不能预防成人结核病复发。即使在儿童,BCG的免疫保护效果在不同地区不同种族中也存在显著差异(0~80%)。第一次成功接种以后,BCG菌株分发到世界各地,几十年来一直在不同地区的实验室中进行增殖,与原始亲本株相比,表型和基因型均有差异,表明BCG在传代过程丢失了许多基因。BCG的无效可能与丢失了许多保护性免疫基因有关。比较基因组学已证实BCG中缺失许多基因。现已鉴定出一些称为RD1~RD16以及包含129 个开放读码框架的区域。这些基因存在于有毒力的分支杆菌中而在BCG减毒和反复传代时缺失。RD1 区是所有缺失域中最具特征性的。该基因片段在所有BCG亚株和大部分环境分支杆菌中缺失,但在结核杆菌复合群的各菌株中存在。另外,环境分支杆菌致敏也是影响BCG效力的一个重要因素。接触环境分支杆菌可获得不同水平的抗结核病感染的保护作用,但不足以控制以后毒力更强的结核杆菌的攻击,却完全阻断了由BCG 正常提供的抗结核杆菌攻击的保护作用。除效力不一致外,标化不足也是其主要缺点之一。同时,BCG作为一种减毒的活疫苗,如果应用于免疫功能有缺陷的患者如HIV 感染者,可能会使BCG在患者体内播散而导致患者死亡。BCG的局限性推动了抗结核病新疫苗的开发。发展安全、高效的新型结核病疫苗势在必行。

  1997 年以来,美国国立卫生研究院(NIH) Orme 等建立了小剂量气溶胶攻击的原发性肺结核病小鼠和豚鼠模型,并利用这些模型对170 多种候选疫苗进行了试验。该院用于结核病研究的经费,从1990 年的340万美元,增加到2000 年的近8000万美元。目前世界范围内正在开发的结核病疫苗包括减毒或增强的活疫苗、全菌体灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗、初免-加强疫苗等。 一、减毒或增强的活疫苗

  活疫苗的优点是可使机体免疫系统受到更接近自然感染途径的刺激,而不会引起病理损害。但同BCG一样,影响以PPD 为抗原的结核病血清学免疫诊断结果。减毒活疫苗沿用了构建BCG的思路。一是通过基因置换和转座子诱变使单个基因位点失活来制备疫苗。使用这种方法已生产出营养缺陷型候选疫苗株。这种营养缺陷型株能导致哺乳动物宿主感染,但复制时间有限,与BCG有相同的保护作用。这预示着免疫功能抑制人群有了较为安全的活疫苗的希望。二是诱导菌体突变,导致毒力减低来构建减毒活疫苗。由于BCG传代过程丢失了RD1 区,导致保护力下降,因此重新改造结核杆菌,使其RD1 区缺失,用结核杆菌RD1 缺失株来验证它是否减毒,在人体存在的时间是否足以引起保护性免疫应答,诱导的免疫应答是否比BCG强。另一种减毒方法是前细胞凋亡法,设计用作疫苗候选株的结核杆菌或BCG突变株的超氧化物歧化酶活性减弱,感染细胞时,细胞凋亡加速,经MHC - I类抗原递呈增加,从而增强CD8+ 介导的杀菌作用。这些理论已得到初步验证。 增强活疫苗的通常方法是,在BCG中引入传代过程中丢失的保护性抗原,或者引入哺乳动物细胞因子、荧光素酶等,以增强BCG的免疫原性。在BCG中引入能够诱导宿主产生细胞免疫的结核杆菌分泌性蛋白保护抗原Ag85B,免疫结果显示,其肺和脾内的细菌数与BCG免疫组相比,显著减少。由RD1 区基因编码的结核分支杆菌早期分泌性抗原性靶(ESAT- 6) ,是从结核杆菌短期培养滤液(ST - CF) 中纯化分离的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,可致结核杆菌再感染小鼠的记快效应T 细胞增殖及IFN - r 早期大量产生,在BCG各菌株中缺乏其编码基因。把RD1 区重新导入BCG,表达的蛋白质同有毒力的牛型分支杆菌和结核杆菌几乎完全相同。与BCG的免疫效果相比,可产生更多高效价的特异性抗体和更为强烈的细胞免疫反应。因此从RD1~RD16中选择基因重新导入BCG ,可能是增强现有BCG保护效力的更为有效的途径。Murray 等分别构建了能分泌IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r、GM-CSF等细胞因子的rBCG。通过免疫小鼠证明,在BCG中加入有免疫增强作用的细胞因子,可增加BCG的免疫效果。

  BCG虽有不足,但有使用广泛、价格低、稳定性好、便于保存等优点,所以rBCG正越来越受到研究者的重视。 二、灭活的全菌体疫苗

  以前已对灭活的全菌体疫苗的预防作用有所认识。在意大利10 万名儿童中接种了全菌体分支杆菌灭活疫苗,显示有一定的预防和降低死亡率的作用。灭活疫苗的最大优点是安全。但接种后在机体内不复制,需反复接种,且用量大。目前,对牦牛分支杆菌灭活疫苗的研究表明,在动物模型中能预防结核病,并能诱导分支杆菌特异性细胞毒性应答。在健康人和感染HIV的BCG初免者中能诱导产生分支杆菌特异性抗体、淋巴细胞增殖和INF-r 产生。2001 年在坦桑尼亚开始评价该疫苗预防HIV感染者结核杆菌菌血症的效力。 三、亚单位疫苗

  由于组成亚单位疫苗的蛋白质或多肽,是以天然蛋白氨基酸或多肽的碱基为基础,利用基因工程方法生产的,故与天然成分具有近似的性质,且产量大、纯度高,可以进行质量控制和标化,制成“鸡尾酒”式的复合疫苗,其安全性也较高。研究表明,结核杆菌保护性抗原基因多属分泌蛋白,具有重要的细胞免疫功能,有很强的CD4+ Th1和CD8+ 细胞毒性应答特性,能产生IFN-r,使动物产生保护性免疫。现已知亚单位疫苗中有明显作用及部分作用的分泌蛋白有Ag85、ESAT-6、MPT-32、MPT- 64 以及热休克蛋白HSP65、HSP70 等,其中最有希望的是分泌型蛋白Ag85 和ESAT-6 ,二者成为近年来研究的热点。 Ag85 是结核分支杆菌主要的分泌性蛋白复合物,是由Ag85A、Ag85B 和Ag85C 3 个组分组成的蛋白质。Ag85A 是结核杆菌抗巨噬细胞的重要成分,可引起结核杆菌感染者强烈的T细胞增殖和INF-r 释放。Ag85A 能诱导结核病人的T细胞应答,因此是诱导细胞产生保护性免疫机制的重要抗原蛋白。小鼠的研究结果显示,以Ag85A 为基础的亚单位疫苗能成功地增强BCG接种后减弱的免疫应答,与活疫苗(BCG) 相反,用选择的几种抗原制备的亚单位疫苗可诱导强烈的特异性免疫应答。

  ESAT-6 蛋白有多个T、B 细胞表位,在BCG各菌株中缺乏其编码基因,能广泛被感染结核菌的不同种属动物及不同遗传背景的个体细胞所识别。这种识别发生在感染早期阶段,在保护性细胞免疫反应中发挥作用,且能介导长期持久的免疫记忆。人类不同HLA 型接种者的淋巴细胞也可能识别共同的表位而产生免疫应答,从而能部分克服由于人群的遗传差异所造成的原有BCG在不同地区保护效果不同的问题。用合适的佐剂配方免疫接种ESAT - 6 可以诱导高水平保护作用。同时用编码ESAT-6的DNA疫苗接种也可激发保护性的应答。甚至从ESAT-6获得的单一表位与DDA/MPL佐剂免疫也能提供有效的、与BCG相仿的保护作用。用Ag85B和ESAT-6融合蛋白的亚单位疫苗免疫小鼠,诱导的保护水平优于单个组分,保护作用比单用Ag85B+ESAT-6和BCG强;并在豚鼠中显示具有与BCG同样的抵抗体质量减轻和存活率低的作用。在环境分支杆菌致敏小鼠中接种2 种不同亚单位疫苗提供的保护效力,与曾经接触过环境分支杆菌无关。这表明,亚单位疫苗可不受致敏作用的影响而能刺激保护性T细胞应答,而BCG的活性依赖于最初的增殖。亚单位疫苗要经过基因克隆、表达和蛋白纯化等复杂的生产过程,有的重组蛋白不能真实地反映抗原蛋白的高级空间结构。此外亚单位疫苗主要诱导体液免疫而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,因而限制了它的应用。 四、DNA 疫苗

  DNA疫苗由编码引起机体保护性免疫反应的病原体抗原基因和真核表达载体构建而成,可诱导全面的免疫反应,特别是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体。这对于消除寄生于巨噬细胞内的结核杆菌非常重要。用结核分支杆菌Ag85A、Ag85B 和Ag85C DNA疫苗分别肌内注射免疫小鼠,在其脾细胞培养上清中,IL-2、INF-r 和TNF-a 水平比BCG免疫鼠显著增高,能产生显著的CTL活性。用Ag85A DNA 疫苗接种C57BL/ 6 鼠,可产生强烈的体液免疫和细胞免疫,对静脉注射和吸入的活结核杆菌H37Rv株的攻击可提供明显的保护作用。Denis 等证实,Ag85 ADNA免疫优于其他二种疫苗,可产生更强、更广泛的T 细胞反应和CTL活性。Morris 等用编码结核杆菌分泌抗源的ESAT- 6、MPT64、MPT63、KatG基因构建的DNA疫苗联合免疫,可产生针对每一抗原成分的特异性体液和细胞免疫,其保护作用与BCG相当。Kamath等用质粒载体构建MPT64、Ag85B和ESAT-6的DNA疫苗免疫小鼠,发现Ag85B DNA疫苗效力最高,ESAT-6 DNA疫苗次之,MPT64DNA疫苗最弱,但三 者均比BCG差。3 种DNA疫苗联合免疫效力优于单个DNA 疫苗。因此多单位DNA 疫苗联合免疫可能是未来预防结核病的实用措施。但用DNA 疫苗免疫的潜在危险是,转入宿主体内的外源基因有可能整合到宿主染色体基因组DNA上,使宿主细胞肿瘤抑制基因失活或肿瘤基因活化,使宿主细胞转化为癌细胞。另外,特定结构和序列的外源DNA可刺激机体产生抗DNA 抗体,理论上有引起自身免疫应答的问题。这也是DNA 疫苗接种应该考虑的安全因素之一。 五、初免—加强疫苗

  连续给予由两种相同或不同抗原进行免疫。一种方法是用两种不同疫苗载体表达相同的抗原组分,先用一种肌内注射免疫,再用另一种作皮内免疫。另一种方法是先用BCG免疫,再用另一种增强免疫。McShane 正在结核菌素皮试阳性和阴性的人群中,探讨BCG初免后,用痘苗病毒株表达的结核杆菌分泌抗原Ag85A加强免疫的效力。也有人研究发现,以Ag85A为基础的亚单位疫苗能成功地增强BCG接种后减弱的免疫应答。 六、展望

  除上述几种疫苗的研究外,有学者对结核病的转基因植物疫苗进行了研究,还有学者利用不同免疫途径研究人体对BCG的免疫应答,观察改变疫苗接种途径后BCG是否更有效。

  理想的结核病疫苗是在出生时接种即可获得终生的保护性免疫。尽管近5 年来结核病疫苗的研究有了很大的进展,但还没有一种疫苗的免疫效果能超过BCG,距实际应用还有很大的距离,距理想疫苗的要求差距更大。鉴于一些侯选疫苗能增强BCG免疫后的效果,而目前大部分人群都已接种过BCG,因此易于接受的方案是增强现有的免疫应答,即与BCG进行联合免疫。随着分子生物学的发展,比较基因组学一定能找出既不影响免疫学判断,又优于BCG的结核杆菌侯选抗原基因,并人工合成用于制备疫苗。对于预防结核病,实现一次免疫、终生受益的愿望不会太遥远了。

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