学科简介更多>>
第四军医大学唐都医院呼吸内科是以医疗、教学、科研为主体任务的综合性科室,是国家首批硕士学位授予学科,博硕士学位授权点,陕西省优势医疗学科,全军呼吸内科专科中心,全军和陕西省支气管镜新技术和呼吸机临床使用培
预约、咨询电话
咨询电话:029-84777725
传 真:029-84777425
您所在的位置: » 内容
结核杆菌DNA疫苗研究进展
作者: 发表日期:2013-11-27


  结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,全世界约有20 亿人感染过结核分枝杆菌,每年约有200~300 万人死于结核病,其人数是其他传染病死亡人数的总和。20世纪末,结核病仍然是全球感染和传染病的第一“杀手”。当前唯一可用的疫苗-卡介苗(BacilleCalmette Guerin,BCG)的免疫效果下降,对其保护效果也存在争议,经试验证明其总有效率仅为50 %。而且对成年人的免疫效果也不明确,因此现在急需研制出新型疫苗。目前新型结核疫苗研制方向主要有:减毒结核疫苗,高表达重组疫苗,蛋白质亚单位疫苗和DNA 疫苗(又称核酸疫苗或基因疫苗)等四种。本文就结核DNA 疫苗的新进展作一简要综述。 1 DNA 疫苗的作用机理

  DNA疫苗的作用机理是能让外源基因在真核细胞内表达,表达出来的蛋白质和MHC-Ⅰ类分子结合后被呈递到细胞的表面,再被CD8+T淋巴细胞的受体识别而诱发CTL的细胞毒反应,这对细胞内寄生的结核杆菌有很强的杀伤作用。但目前对DNA 疫苗激活免疫系统的详细机理还不是很清楚,不过有以下几种机制可对此进行解释:①DNA 疫苗直接致敏体细胞;②基因疫苗转染APC(抗原递呈细胞-巨噬细胞或树突状细胞);核酸疫苗在APC 内表达的蛋白质抗原作为“内源性抗原”,结合MHC-Ⅰ类分子后被T 细胞受体识别,这是诱导细胞毒T 细胞的最有效的途径;③交叉致敏;④细菌质粒具有免疫佐剂功能[1]。当人或小鼠感染结核菌后,巨噬细胞(MΦ)吞噬结核菌但却不能将其杀灭。因此结核菌在MΦ中生存繁殖,外来药物与抗体也无法直接消除结核菌。只有人MΦ被抗原特异的细胞毒性T 细胞溶解后,其中寄生的毒性结核菌才能被杀死。因此可以设想,杀菌性T 细胞的功能低下导致了小鼠感染结核菌后免疫抵抗力的下降,造成慢性感染,在人体也可发生类似情况。在主动免疫的机制中,可溶性蛋白抗原主要刺激CD4+T 细胞反应,而DNA 疫苗则可引起强烈的CD8+T 细胞反应,诱导产生大量的抗原特异性CD8+/ CD4- / CD44 high T 细胞,分泌IFN-γ[2],引起有效的细胞免疫。 2 编码抗原基因重组的DNA 疫苗

  1996年8月出版的《自然医学杂志》同时刊登了Huygen和Tascon两位博士各自分别完成的结核病DNA疫苗的论文,1998 年英国剑桥Sanger 中心完成结核杆菌基因组序列的测定,为结核DNA 疫苗的研制提供了保证,使其研制进入飞跃发展阶段。实验证明结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性抗原,因此主要的结核DNA疫苗都是将编码这些抗原的基因克隆到载体中构建而成的。目前结核DNA 疫苗的研制主要有:以Antigen85 和hsp65,以及结核杆菌培养过滤液中的分泌蛋白ESAT-6 和MPT-64 编码基因重组的DNA 疫苗[3]。

  2. 1 以Antigen85 编码基因构建的DNA 疫苗

  在结核菌和BCG 的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(Antigen85 complex),由Ag85A,Ag85B,Ag85C组成的30~32kD 蛋白家族,分别由三种不同但高度同源的基因编码。在感染结核或麻风菌与卡介苗免疫的小鼠及人体上,Ag85 复合体不仅可以刺激产生体液免疫,尚可激发较强Th1 型细胞免疫,引起CD8+ T 细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升。结核病的免疫学特征表现为细胞免疫功能低下,研究结果显示CD8+T细胞的保护功能可能与IFN-γ诱导有关,这些实验揭示可利用Ag85 复合体基因构建DNA 疫苗。其中Ag85A 和Ag85B 被认为更有效,一些实验已证实,由Ag85A 和Ag85B 编码的DNA 疫苗对小鼠抵抗由呼吸道或静脉感染的结核菌有保护作用[4],目前一些研究小组正在致力于此方面的研究。 2. 1. 1 Ag85A

  用含结核菌38kD 蛋白基因与Ag85A 及HSP65 编码基因构建的DNA 疫苗免疫的动物模型中,可产生很好的免疫保护作用。以人工合成的包括Ag85A 全部20 肽刺激小鼠脾细胞分泌IL-2,IFN-γ为指标,发现DNA 免疫诱导产生的T细胞反应在强度和广度上均比皮下注射结核菌感染的效果好,CTL 活性也上升。编码Ag85A 的DNA 疫苗与BCG 有同样的诱导保护作用。

  Huygen把结核杆菌的抗原85A基因克隆到美国Merk公司的VIJ载体中构建了DNA疫苗,然后将DNA在体外转染肌肉瘤细胞,证明了DNA疫苗能够在真核细胞中表达结核杆菌的抗原85A蛋白质。给Balb/c和C57BL/6小鼠肌肉注射Ag85A疫苗,能在小鼠体内诱发很强的体液和细胞免疫反应。 2. 1. 2 Ag85B

  由MTB (Mycobacterium tuberculosis)H37Rv 基因组编码,用其作为亚单位疫苗与多个蛋白疫苗比较或与其他基因疫苗比较[4],均表明Ag85B 是MTB 较好的保护性靶抗原之一。研究表明Ag85B 基因免疫小鼠可以产生较高水平的IFN-γ和脾淋巴细胞显著增殖为特征的细胞免疫反应。将此小鼠的T 细胞过继免疫给正常小鼠后,对MTB 毒株的感染有一定的保护性[5]。相继用编码Ag85B的DNA 疫苗和卡介苗免疫,其对抵抗结核杆菌的感染比单独用卡介苗更为有效[6]。Li和Kamath各自分别将Ag85B基因克隆到pJM4303载体中,用于免疫C57BL/6小鼠,都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应。在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒菌后,均获得了接近BCG的免疫保护力。 2. 1. 3 Ag85C

  对于Ag85C 基因重组的DNA 疫苗,目前发现其效果远远不及85A 和85B 。也有研究人员对此进行对比研究[7]。有学者发现[7]利用tPA( Tissue plasminogen acti 2vator 组织纤维蛋白溶酶原激活因子)信号序列为增强子可使编码85A,85B 和ESAT-6 的重组疫苗高水平表达,而Ag85C 编码基因重组的DNA 疫苗却没有明显效果。Ag85 基因重组疫苗免疫过的小鼠中,受tPA 免疫的小鼠脾细胞产生的IL-2, IFN-γ大大增加,利用tPA 信号序列可增强Ag85 基因重组疫苗的免疫原性,这为将来的疫苗设计起到重要启示。 2. 2 以hsp65

  编码基因构建的DNA 疫苗hsp65( Heat shock protein65)是由HLA 2 DR 和2 DQ复合基因编码的65kD 蛋白。据Tascon 等人报道,表达麻风分枝杆菌hsp65 的重组质粒有与BCG 相似的抗结核作用。以hsp 2 65 编码基因构建的DNA 疫苗可诱导产生大量的IFN-γ,使T 细胞转化为CD8+ / CD44 hi T 细胞。将其接种后至8 个月保护性T细胞数量和免疫水平持续上升, 15 月后逐渐下降[8]。在免疫后8 ~15 月,CTL 仍有作用。而与此对照,接种卡介苗,产生IFN-γ诱导T 细胞转化为CD4+ /CD44 lo T 细胞,在过继转移实验中CD4+ /CD44 lo T 细胞被证实没有免疫保护作用,而CD8+ /CD44 hi T 细胞才具有保护作用,因此接种DNA 疫苗的小鼠比接种卡介苗的小鼠更易受到保护。用全长的Mhsp65 编码的DNA 疫苗可以诱导特异性MHC-Ⅰ和Ⅱ型T 细胞反应[9]。因此在MHC -ⅠCTL 细胞介导的抗结核免疫反应中Mhsp65(9369 )有着广阔研究前景,甚至可考虑用其来诱导免疫保护以抵抗更为广泛的各种病原体。 2. 3 以ESAT-6 编码基因构建的DNA 疫苗

  ESAT-6 是由结核分枝杆菌( M. t uberculosis)毒株和牛型分枝杆菌( M. bovis)毒株分泌的低分子量T 细胞抗原。它是结核杆菌早期分泌性蛋白质中诱导T细胞免疫反应能力最强的蛋白质。能有效刺激病人外周血中CD4+ T 细胞增殖和诱导IFN-γ产生。在小鼠感染模型中, ESAT-6 特异性T 细胞主要是CD45RBlowCD44highLFA-IhighL 2selectinlowCD4+ T 细胞(可能是一种长效记忆性T 细胞),它较易分泌IFN-γ[10]。敲除ESAT6 基因能够导致结核杆菌失去毒性,因此可从牛型结核杆菌中获得活菌疫苗,并能应用于鉴别小鼠是疫苗免疫还是结核感染[11]。因为试验中接种敲除ESAT-6 基因的变异结核菌株和接种毒型结核菌株的小鼠都对PPD阳性,而只有后者对ESAT-6 试验阳性。研究表明肌注单独由编码ESAT-6 的DNA 疫苗难以取得理想效果[4],因为ESAT-6 不是很强的免疫原。Kamath [4]等认为编码ESAT-6DNA 疫苗的保护作用比MPT64 强,但这两种DNA 疫苗的保护作用并未超过BCG,所以需要加入其它免疫刺激源,如细胞因子,才能取得良好效果。

  Li等在构建ESAT6 DNA疫苗时,对能表达信号肽和不能表达信号肽的DNA疫苗进行了比较。结果表明,这两种ESAT6 DNA疫苗的免疫保护力都很高,而且试验的重复性很好。 2. 4 以MPT编码基因重组的DNA 疫苗

  MPT-64 是结核菌生长过程中的分泌性蛋白,也是重要的T 细胞抗原,能诱发结核菌感染的豚鼠发生很强的DTH 反应。1999 年Kamath 等首次将结核分枝杆菌的MPT-64 蛋白编码基因经骨骼肌注射免疫C57BL/ 6 小鼠,第一次免疫后2 周即可产生特异性抗体,每间隔3 周免疫一次,共3 次,免疫过程中血清中特异性抗体滴度逐渐增高。目前设想MPT-64 主要诱导细胞免疫应答,体液免疫应答不是其主要反应,这需进一步研究其细胞免疫应答加以证实。国内有研究认为,结核分枝杆菌MPT-64 DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答,免疫效果存在明显个体差异[12]。部分BCG 在减毒的过程中丢失了编码MPT64 的基因,可用MPT64 代替PPD 作为皮试试剂,且其特异性较强,因此可以鉴别小鼠是用BCG免疫过还是结核感染。

  MPT-63蛋白质也有很强的刺激T淋巴细胞免疫反应的能力。Li等将MPT-63基因克隆到pJW4303载体中构建的DNA疫苗也显示了较好的免疫保护效果;但是还需要进一步证明其免疫保护力的重复性。

  2. 5 其他编码抗原基因构建的DNA 疫苗

  目前对结核杆菌其他成分及其DNA 疫苗免疫效果的研究仍在深入进行。DNA 疫苗编码的蛋白还有38kD 蛋白, hsp70 和36 与6kD 蛋白。PstS-1,PstS-2,PstS-3 蛋白免疫小鼠可以刺激特异性抗体产生(lgG),并刺激生成Th1 型细胞因子IL 2 1 和IFN-γ。PstS-1 DNA 免疫不能激发细胞免疫应答,PstS-2 DNA免疫仅可引起中等水平的应答。而PstS- DNA 免疫可产生高水平的应答[13]。目前一个主要障碍是还没有准确分离出结核菌的保护性抗原,但在小鼠和豚鼠实验中证实,结核菌的分泌性抗原和表面抗原比胞质抗原更易引起保护性反应,控制结核菌的复制[13]。因此将在这些抗原中进行更深一步的研究,寻找新型DNA 疫苗。 3 应用前景的展望

  结核DNA疫苗的研究历史虽然很短,但是在小动物的试验研究结果还是十分令人鼓舞的[4]。目前的研究重点还是在筛选不同的结核杆菌基因,然后在初步筛选出来的候选者中,进一步在豚鼠实验中进行验证和精选。由于豚鼠是结核杆菌的敏感动物,因而攻击后脏器中的活菌数可能在免疫组和对照组之间差异不大,但是以组织的病理改变作为指标,则可以显示出DNA疫苗的免疫保护效果。在众多结核DNA疫苗的动物实验中,很少能够在动物试验中具有BCG同样的,甚至超过BCG的免疫保护力。例如:Carl G. Feng 发现单独用编码Ag85B 的DNA 疫苗免疫,其减少菌落数效果不如BCG [6]。但如果接着接种BCG,其免疫效果就会显著提高,脾中菌落数下降到1/ 100,而单独用BCG 只能下降到1/ 10 。因为对DNA 疫苗致敏的TB 特异性CD8+ T细胞,BCG能起到放大其功效作用,还能极大提高Th1 型CD4 +T 细胞反应,而后者是抵御MTB 的关键。通过单独免疫去筛选保护力强的DNA 疫苗,然后加入合适的促进剂,将会使其免疫效果大大增强。组成联合疫苗未来结核菌DNA 疫苗的研究方向。DNA 疫苗不仅可以预防感染,还有治疗作用。给严重感染的小鼠接种DNA 疫苗,小鼠免疫系统就能从原来的抑制状态转换到杀灭滞留结核杆菌的状态。不仅可以防止形成持续感染,还可以使已经形成的持续感染得到清除[2]。可以展望将这种基因治疗与传统的化疗结合起来可能会更好更快地治疗人类的结核病。DNA 疫苗可引起细胞免疫和体液免疫,这不仅仅取决于抗原的性质,还与DNA 疫苗的接种途径(如肌肉注射或基因枪注射),接种量密切相关。基因免疫中引起细胞免疫应答比引起体液免疫应答所需要的抗原量要少,即以低剂量接种时较易引起细胞免疫应答;高剂量接种时则体液免疫应答占优势。因此可利用DNA 疫苗接种的量来影响免疫应答的类型。

  为了增强结核DNA疫苗的免疫保护效果,目前有如下几个研究方向:多价疫苗;免疫调节因子;加速抗原的降解;鼻内接种途径。未来的DNA 疫苗关键是要在诱导INF-γ的分泌和CD8+ T 细胞产生,以引起有效的细胞免疫。利用编码多肽的DNA 疫苗将可能提高抵抗各种疾病的疫苗的效果,选择合适的结核菌蛋白编码基因和改造载体以增加DNA 疫苗的表达水平,制定完善的免疫策略和途径、插入免疫调控序列和开发新型佐剂增强免疫应答、提高DNA 疫苗的安全性等是今后研究的重点。

权所有:第四军医大学唐都医院呼吸内科
咨询电话:029-84777725 传真:029-84777425 地址:陕西省西安市灞桥区新寺路1号